Diese Studie zeigt einen quantitativen Phasen bildgebung sansatz mit Einzel belichtung, der die Beobachtung der intra zellulären Trockenmasse dynamik in lebenden Zellen im Millisekunden bereich ermöglicht. Durch die Integration einer kaskadi erten dualen nicht polarisieren den Strahlteiler architektur in eine Hochleistungs-sCMOS-Kamera (Revealer Gloria 4.2) werden vier phasen verschobene Inter fero gramme gleichzeitig innerhalb eines Rahmens erfasst. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die sCMOS-Kamera nicht nur als Bildgebung sensor, sondern auch als zeitlichen Synchron isations kern fungiert und einen hohen Durchsatz und ein geringes Rauschen ermöglicht. und quantitativ zuverlässige Phasen rekonstruktion in dynamischen biologischen Systemen.
Die quantitative Phasen bildgebung (QPI) bietet eine markierung freie Messung der optischen Dicke, des Brechung index und der Trockenmasse verteilung in biologischen Proben und ist damit ein grundlegendes Instrument zur Untersuchung der Dynamik lebender Zellen. Die konventionelle räumliche Licht interferenz mikroskopie beruht jedoch auf der sequentiellen Erfassung mehrerer phasen verschobener Frames, wodurch die zeitliche Auflösung grundlegend begrenzt und die genaue Erfassung schneller sub zellulärer Ereignisse im Millisekunden maßstab verhindert wird.
Bestehende Einzel belichtung lösungen, einschl ießlich Polarisation multiplex und beugung basierter Aufteilung, verbessern die Erfassungs geschwindigkeit, beeinträchtigen jedoch häufig das Produkt der Raum bandbreite oder führen zu einem Intensität ungleich gewicht zwischen den Kanälen. wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis und die Mess treue verringert werden. Diese Einschränkungen wirken sich direkt auf die Zuverlässigkeit der quantitativen Phasen rekonstruktion in dynamischen Systemen aus.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelt die vorliegende Studie ein Einzelbelichtung-Raumlicht-Interferenz mikroskopie system (SE-SLIM), das auf kaskadi erten nicht polarisieren den Strahlteilern basiert. Diese Konfiguration gewähr leistet eine gleiche Intensität verteilung über vier optische Pfade, während die räumliche Auflösung erhalten bleibt. Entscheidend ist, dass die Einführung einer sCMOS-Kamera mit hoher Bildrate und geringem Rauschen die gleichzeitige Erfassung von inter fero metrischen Mehrkanal-Informationen innerhalb einer einzigen Belichtung ermöglicht. Eliminierung von zeitlichen Fehl anpassungs fehlern, die sequentiellen Bildgebung systemen inhärent sind.
Das Bildgebung system integriert ein kommerzielles Hellfeld mikroskop in ein quantitatives Phasen modul, in dem die sCMOS-Kamera als zentrale Daten erfassungs einheit dient. Die Revealer Gloria 4.2 sCMOS-Kamera bietet eine Auflösung von 2048 × 2048 Pixel mit einer Pixelgröße von 6,5 μm und arbeitet unter Vollbild bedingungen mit 135 Bildern pro Sekunde. Seine hinter leuchtete wissenschaft liche CMOS-Architektur liefert eine Quanten effizienz von bis zu 95% und ein Lese rauschen von nur 1,2 Elektronen, was eine präzise Erkennung schwacher inter fero metrischer Streifen ermöglicht.
Die optische Konfiguration baut auf einer breitbandigen Halogen-Beleuchtungs quelle auf, die mit einem ringförmigen Beleuchtungs modul gekoppelt ist. Das einfallende Licht wird zunächst unter Verwendung eines nicht polarisieren den Strahlteilers und eines rechtwinkligen Prismas in zwei Strahlen unterteilt. Eine zweite identische Stufe teilt jeden Strahl weiter in zwei, was zu vier parallelen Strahlen mit gleicher Intensität führt. Ein räumlicher Licht modulator wendet diskrete Phasen verschiebungen von 0 °, 90 °, 180 ° und 270 ° auf diese Strahlen an. Nach der Ausbreitung durch eine Fourier linse werden vier räumlich getrennte Inter fero gramme auf der Sensore bene der sCMOS-Kamera gebildet.
Innerhalb dieser Architektur ist die sCMOS-Kamera nicht nur ein Detektor, sondern die einzige Komponente, die alle phasen verschobenen Signale in einer einzigen Belichtung synchron erfassen kann, wodurch eine echte parallele Phasen erfassung ermöglicht wird.
Die Imaging-Strategie kombiniert eine parallele vierstufige Phasen verschiebung mit einer Einzelbild erfassung. Der räumliche Licht modulator führt eine gesteuerte Phasen modulation über die vier optischen Kanäle ein, während die sCMOS-Kamera alle entsprechenden Intensität verteilungen gleichzeitig aufzeichnet. Dies stellt sicher, dass alle Phasen informationen unter identischen zeitlichen Bedingungen abgetastet werden.
Die aufgenommenen Bilder werden unter Verwendung eines in MATLAB implementierten SURF-basierten Segment ierungs-und Registrierung algorithmus verarbeitet. Die Phasen rekonstruktion wird anschließend unter Verwendung einer arktangenten basierten Berechnung durchgeführt. Da alle Eingabedaten aus einer einzelnen Exposition stammen, ist der Rekonstruktion prozess von Natur aus frei von Phasen drift zwischen den Rahmen, was in herkömmlichen Systemen eine übliche Einschränkung darstellt.
Dynamische bildgebende Experimente werden an roten Blut körperchen und HeLa-Zellen unter DMSO-Stimulation durchgeführt. Die sCMOS-Kamera zeichnet zeitliche Hoch geschwindigkeit sequenzen auf und liefert einen kontinuier lichen Datensatz, der die quantitative Analyse der morpho logischen Evolution und der intra zellulären Trockenmasse umverteilung direkt unterstützt.
Die Revealer Gloria 4.2 sCMOS-Kamera liefert direkte Beobachtungs nachweise für die System kalibrierung, Phasen rekonstruktion und dynamische Live-Zell-Bildgebung.
4.1 Zeitliche Synchron isation und Einzelrahmen-Erwerb
In herkömmlichen SLIM-Systemen sind vier unabhängige Belichtungen erforderlich, um einen vollständigen Satz phasen verschobener Daten zu erhalten. Im Gegensatz dazu erfasst die in dieser Studie verwendete sCMOS-Kamera alle vier Kanäle innerhalb eines einzelnen Rahmens mit 135 fps und erhöht die zeitliche Auflösung effektiv um den Faktor vier. Diese Single-Frame-Erfassung eliminiert Phasen fehler, die durch Sample-Bewegungen oder Beleuchtungs schwankungen zwischen Frames verursacht werden.
Die experimentellen Beobachtungen zeigen, dass die sCMOS-Kamera als zeitlicher Verein iger fungiert, um sicher zustellen, dass alle Phasen informationen unter identischen Bedingungen erfasst werden. Diese Fähigkeit ist für eine genaue Phasen rekonstruktion in dynamischen biologischen Systemen unerlässlich.
Abbildung 1 Single-Belichtung Vier-Kanal-Synchron-Erfassungs mechanismus der sCMOS-Kamera. Im Vergleich zum traditionellen Multi-Frame-Erfassungs prozess zeigt es eine einheitliche zeitliche Abtast fähigkeit.
4.2 Phasen empfindlichkeit und Systems tabilität
Die Ergebnisse der System kalibrierung zeigen, dass die Phasen auflösung besser als 500 nm ist, wobei die räumliche Phasen empfindlichkeit 1,84 nm und die zeitliche Phasen empfindlichkeit 0,82 nm erreicht. Die kontinuierliche Erfassung bei 256 fps zeigt, dass die zeitliche Verteilung der Phasen werte ohne beobachtbare Drift oder abrupte Rausch schwankungen sehr stabil bleibt.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass das geringe Lese rauschen und die hohe Quanten effizienz der sCMOS-Kamera direkt zu einer Phasen empfindlichkeit im Nanometer bereich führen. Die Stabilität der Kamera ermöglicht eine langfristige Hoch geschwindigkeit erfassung ohne Verschlechterung der Mess genauigkeit.
Abbildung 2 Statistische Ergebnisse des Phasen rauschens basierend auf der kontinuier lichen Hoch geschwindigkeit erfassung durch die sCMOS-Kamera, die die zeitliche Phasen stabilität und den Ursprung der nanos ka ligen Empfindlichkeit veranschaulichen.
4.3 Quantitative Genauigkeit validierung unter Verwendung von Standard proben
Die quantitative Abbildung von 10 μm Polystyrol-Mikro kugeln zeigt die Genauigkeit des Systems. Der rekonstruierte durchschnitt liche Durchmesser beträgt 10,48 μm mit einem Fehler unter 4%, während der gemessene Phasen peak um weniger als 4% von den theoretischen Vorhersagen abweicht.
Die sCMOS-Kamera erfasst inter fero metrische Signale mit hoher Wiedergabe treue, ohne Signal verlust oder Verzerrung und bietet eine zuverlässige Grundlage für die quantitative Phasen rekonstruktion auch unter schwachen Signal bedingungen.
Abbildung 3 Statistische Ergebnisse von Mikrosphären-Interferenz signalen und Phasen rekonstruktion konsistenz, die von der sCMOS-Kamera erfasst wurden, überprüfen ihre lineare Reaktion und Stabilität bei der quantitativen Messung.
4.4 Dynamische Bildgebung von lebenden Zellen
Die Hoch geschwindigkeit abbildung mit 135 fps über eine kontinuierliche Dauer von 6,4 Sekunden ermöglicht eine detaillierte Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse. Das System erfasst osmotische Schwellungen und morpho logische Abflachungen der roten Blut körperchen sowie Kontraktion, Membran ruptur und Vesikel bildung in HeLa-Zellen unter DMSO-Stimulation.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die sCMOS-Kamera eine Echtzeit-, beschriftung freie und quantitative Überwachung der Zell dynamik ermöglicht. Seine Fähigkeit, zeitliche Daten mit hoher Bildrate bereit zustellen, ist entscheidend für die Auflösung vorübergehen der biologischer Ereignisse, die in der Millisekunden zeit auftreten.
Abbildung 4 Dynamische Zell sequenzen und Trockenmasse entwicklungs kurven, die von der sCMOS-Kamera mit 135 fps kontinuierlich erfasst werden und die zeitliche Kontinuität bei der Beobachtung biologischer Hoch geschwindigkeit prozesse widerspiegeln.
Diese Studie etabliert ein Einzel belichtung SE-SLIM system, bei dem die sCMOS-Kamera eine zentrale und unersetzliche Rolle bei der Bestimmung der System leistung spielt. Durch die gleichzeitige Erfassung von vier phasen verschobenen Inter fero grammen innerhalb eines Rahmens verbessert die Kamera die zeitliche Auflösung grundlegend und eliminiert Interframe-Phasen fehler.
Die hohe Bildrate ermöglicht die vollständige Erfassung der zellulären Dynamik im Millisekunden bereich, während das geringe Rauschen und der hohe Dynamik bereich eine zuverlässige Erkennung schwacher inter fero metrischer Signale gewährleisten. Das große Sensor format behält auch nach der Segment ierung in mehrere Kanäle eine ausreichende räumliche Abtastung bei und unterstützt eine genaue Subpixel-Registrierung und quantitative Rekonstruktion.
Zusammen genommen zeigen die Ergebnisse, dass die sCMOS-Kamera nicht nur eine Bildgebung komponente ist, sondern die Schlüssel technologie, die Durchsatz, Empfindlichkeit und dynamische Mess fähigkeit in quantitativen Phasen bildgebung systemen mit hoher Geschwindigkeit definiert. Diese Arbeit bietet eine reproduzierbare Lösung auf Geräte ebene für die markierung freie Echtzeit beobachtung der Dynamik lebender Zellen.
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